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小鼠小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞 冷凍細(xì)胞操作步驟：

1．收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；
2．以25μl臺(tái)盼藍(lán)溶液稀釋25μl細(xì)胞懸液；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率（至少應(yīng)該在90%以上）；
3．細(xì)胞懸液在4℃ 條件下200磄離心10分鐘；
4．將沉淀的細(xì)胞重新懸浮在冷凍液中（大約5?06細(xì)胞/0.5 ml 冷凍液）；
5．將細(xì)胞懸液加入到冷凍管中，每管0.5 ml；
6．將冷凍管置于-80℃冰箱中；
7．24小時(shí)后，將冷凍管移入液氮罐中；
8．在記錄本或電腦中記錄下每一個(gè)冷凍管的位置以確保在以后應(yīng)用時(shí)能夠找到每一個(gè)冷凍管。

細(xì)胞復(fù)蘇操作步驟：
1．將冷凍管迅速由液氮轉(zhuǎn)入到37℃水浴中，冷凍管的頂部保持在水面以上以避免任何污染，不定時(shí)攪拌加速解凍；
2．當(dāng)細(xì)胞*解凍后，用含70%乙醇的紗布擦拭冷凍管消毒；
3．將解凍后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含4℃預(yù)平衡培養(yǎng)液的試管中；
4．細(xì)胞懸液在4℃下200磄離心10分鐘；
5．棄上清，將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)液中；
6．將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，CO2孵箱中培養(yǎng)；
7．是用倒置顯微鏡檢查細(xì)胞存活率以及細(xì)胞密度，如果細(xì)胞密度過高，用培養(yǎng)液稀釋至適宜濃度。

培養(yǎng)條件：
*培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基90%；胎牛血清10%。
培養(yǎng)條件：37.0C carbon dioxide（CO2）,5%